Page 168 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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               对 GSH 的消耗，通过促进 Nrf2入核激活下游抗氧化                     1.2  主要仪器设备
               酶 HO-1 和 NQO1 的表达，增强细胞内抗氧化系统，                        超声破碎仪，VCX750，美国索尼克斯；全波长酶
               发挥抗氧化活性       ［10］ 。                             标仪，MULTISKAN GO，美国 Thermo 公司；高效液
                   本研究以新鲜干燥果皮以及贮藏 1、10 a 的广陈                    相色谱仪，e2695，美国 Waters 公司；微量核酸测定
               皮为研究对象，分析广陈皮在陈化过程中黄酮类化                           仪，NanoDrop2000，美国 NanoDrop Technologies 公
               合物的含量变化；以 t-BHP 诱导氧化应激损伤的人                       司；电泳仪，DYY-8C，北京六一仪器厂；凝胶成像系
               肝癌细胞 HepG2 细胞为模型，探究 PCR-CF 的抗氧                   统 ，Gel Doc XR+ ，美 国 LI-COR 公 司 ；荧 光 定 量
               化活性作用，并通过 qRT-PCR 和 Western blot 技术              PCR 仪，Qtower2.2，德国 Analytik JenaAG 公司；垂
               研究 PCR-C10F 的抗氧化作用分子机制，旨在探究                      直电泳槽，DYCZ-24DN，北京六一仪器厂；电转仪，
               广陈皮在陈化过程中黄酮类化合物含量变化与抗氧                           DYCZ-40，北京六一仪器厂。
               化活性的相关性，为陈皮的品质控制及合理使用提                           1.3  试验方法
               供理论参考。                                               1）HepG2细胞的培养。细胞培养于含 10% 胎牛

               1    材料与方法                                       血清、1% 双抗及 MEM 基础培养基中，置于 37 ℃，
                                                                5% CO 2 细胞培养箱中，待其长至瓶壁的 80% 左右，
               1.1  试验材料                                        用胰蛋白酶消化传代，每隔3~4 d传代1次。
                   人肝癌细胞（human hepatoma cell，HepG2 cell）            2）广陈皮中黄酮类化合物的提取纯化。参照笔
               购买于中科院上海细胞库干细胞库。新鲜果皮、贮                           者所在实验室前期研究方法            ［11］ ，用 80% 乙醇超声辅
               藏 1 a和 10 a的 PCR-C 药材，购自广东省江门市新会                 助提取，料液比 1︰20（g/mL），超声辅助提取 30 min，
               区双水镇柑泽园，样品经湖北中医药大学药学院鉴                           超声频率 40 kHz，功率 480 W，提取温度 25 ℃。用
               定。MEM 培养基购于美国 Gibco 公司；胎牛血清购                     HPD300 树脂进行纯化富集 ，最后冷冻干燥得到
               于南乌拉圭 Quacell 公司；色谱级的乙腈购于美国                      PCR-CF。
               Fisher公司；色谱级的甲酸购于天津市科密欧化学试                           3）HPLC 分析。参照笔者所在实验室前期研究
               剂有限公司；BCA 法蛋白测定试剂盒（BCA02）购于                      方法 ［11］ ，使用 Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（250
               北 京 鼎 国 昌 盛 科 技 有 限 公 司 ；GSH（A006-2-1）、 mm×4.6 mm，5 μm），0.1% 甲酸水（A）和乙腈（B）作
               MDA（A003-4-1）、T-SOD（A001-1-2）试剂盒购于南              为 流 动 相 ，梯 度 洗 脱 条 件 为 15%~25% B（0~5
               京建成生物科技有限公司；RNApure 超纯总 RNA 快                    min），25%~35% B （5~20 min），35%~45% B
               速提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司； （20~40 min），45%~75% B（40~45 min），75%~
               荧光定量 PCR 所用引物合成，购于北京擎科生物科                        85% B（45~50 min），85%~15% B（50~55 min），
               技公司；TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 荧光             保持 15% B 持续 5 min。色谱柱温度为 25 °C，流速
               定量试剂盒和 TaKaRa Prime Script RT reagent Kit        为 1 mL/min，进样量为 20 μL，设定 280、330 nm 波长
               with gDNA Eraser 反转录试剂盒（RR047A），均购于              进行检测。
               宝生物工程（大连）有限公司；细胞核蛋白与细胞浆                              4）SOD、GSH、MDA 水平的测定。参照笔者所
               蛋 白 抽 提 试 剂 盒（P0028）；小 鼠 单 抗 β -actin            在实验室前期研究方法          ［11］ ，将生长状态良好、处于对
                                                                                               5
              （BM0627）、HRP标记羊抗小鼠二抗（BA1051）、HRP                  数生长期的 HepG2 细胞按照 5×10 个/mL 接种于 6
               标记羊抗兔二抗（BA1054）均购于武汉博士德生物                        孔板中，过夜，待细胞贴壁生长。向样品组和样品对
               工程有限公司；兔多抗 Nrf2（A0674）购于武汉爱博泰                    照组加入 50 μg/mL PCR-CF 样品，设置空白对照组
               克生物科技有限公司；兔多抗 HO-1（10701-1-AP）购                  和模型组，加入基础培养基，药物作用 24 h 后，模型

               于 武 汉 三 鹰 生 物 技 术 有 限 公 司 ；兔 多 抗 NQO1            组及样品组均加入 300 μmol/L t-BHP 刺激诱导细
              （DF6437）购于美国 Affinity Biosciences 公司；兔多抗          胞 3 h。待细胞处理结束后，收集细胞超声破碎取上
               SOD1（PA5-27240）购于美国 Invitrogen 公司；兔单抗            清，按 SOD、GSH、MDA 试剂盒说明书进行操作测
               GSTO1（ab138491）和兔多抗 GSH-Px（ab22604）购             定 各 个 指 标 ，并 按 照 BCA 蛋 白 试 剂 盒 测 定 蛋 白
               于 Abcam 公司；小鼠单抗 Histone H3（bsm-33042M） 含量。
               购于北京博奥森生物技术有限公司。                                     5）实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测基因表
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