Page 169 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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第 5 期      陶叶杏 等：广陈皮中黄酮类化合物提取物对 t-BHP 诱导 HepG2 细胞氧化损伤保护作用机制                               163

               达 水 平 。 将 生 长 状 态 良 好 、处 于 对 数 生 长 期 的           行试验，数据结果以平均值±标准偏差（Mean ±
                                    5
               HepG2 细胞按照 6×10 个/mL 浓度接种于 12 孔板                 SD）表示。采用 IBM SPSS Statistic Version 25.0 统
               中，过夜，待细胞贴壁生长。向样品组和样品对照组                          计软件分析数据，多组间比较采用单因素 ANOVA
               加入 50 μg/mL PCR-C10F 样品，设置空白对照组和                 方差分析，P<0.05时认为有显著性差异。
               模型组，加入基础培养基，药物作用 24 h 后，模型组                      2   结果与分析
               及样品组均加入300 μmol/L t-BHP刺激诱导细胞3 h。
               待细胞处理结束后，采用 RNA pure 超纯总 RNA 快                   2.1  PCR-CF中主要黄酮类化合物的含量变化
               速 提 取 试 剂 盒 进 行 RNA 的 提 取 ，使 用 TaKaRa                PCR-CF 中主要黄酮类化合物含量如图 1 所
               PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转   示 ［12］ ，新鲜陈皮中，橙皮苷含量最高，其他主要黄酮
                                                                类化合物如：异橙黄酮、甜橙黄酮、5，7，8，4'-四甲氧
               录试剂盒对 RNA 进行反转录，使用 TaKaRa SYBR
               Premix Ex TaqTM Ⅱ 荧光定量试剂盒进行 qRT-                 基黄酮、川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮、

               PCR分析。以 GAPDH为内参，采用 2            --ΔΔCT 法计算目     橘皮素以及多甲氧基黄酮（PMFs）的总含量在贮藏
               的基因的相对表达量。所用引物如表1所示。                             10 a的陈皮中含量较高。
                              表1   引物序列信息
                            Table 1  Primers sequence
                 基因                                   参考文献
                               序列（5′-3′）Primers
                 Gene                                 Reference
                       F: GGAGTCAACGGATTTGGT
                GAPDH                                   [12]
                       R: GTGATGGGATTTCCATTG
                       F: CTTGGCCTCAGTGATTCTGAAGTG
                Nrf2                                    [12]
                       R: CCTGAGATGGTGACAAGGGTTCTA
                       F: ATGGCCTCCCTGTACCACATC
                HO-1                                    [12]
                       R: TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT
                                                                 1. 橙皮苷 Hesperidin；2. 异橙黄酮 Isosinensetin；3. 甜橙黄酮 Si⁃
                       F: GGATTGGACCGAGCTGGAA
                NQO1                                    [12]    nensetin；4.5，7，8，4'-四甲氧基黄酮 5，7，8，4'-Tetramethoxyflavone；
                       R: AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC              5.川陈皮素Nobiletin；6.3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮3，5，6，7，8，
                       F: AGGACGCGTCTAGTCCTGAA                  3'，4'-Heptamethoxyflavone；7.橘皮素Tangeretin；8.PMFs.
                GSTO1                                   [12]
                       R: TTCCCTGGGTATGCTTCATC                        图1  PCR-CF中主要黄酮类化合物的含量
                       F: GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG                   Fig.1  The contents of main flavonoids in PCR-CF
                SOD1                                    [13]
                       R: CCACAAGCCAAACGACTTCC
                                                                2.2  PCR-CF 对 t-BHP 诱导的 HepG2 细胞氧化损
                       F: CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG
                GSH-Px                                  [13]    伤的影响
                       R: GAGGGACGCCACATTCTCG
                                                                    细胞内 SOD、GSH 和 MDA 水平可以反映抗氧
                   6）蛋白免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达。                化活性水平。如表 2所示，与模型组相比，Fresh-F 和
               细胞的处理与分组与 RNA 提取的细胞处理方式一                         PCR-C10F 均 能 显 著 提 高 HepG2 细 胞 中 SOD 和
               致。用加入了蛋白酶抑制剂（PMSF）的 RIPA 细胞                      GSH 的活力（P<0.05），特别地，PCR-C10F 水平显
               裂解液进行细胞总蛋白的提取。按照细胞核蛋白与                           著 高 于 Fresh-F（P<0.05）；此 外 ，Fresh-F、PCR-
               细胞浆蛋白抽提试剂盒的方法得到细胞核蛋白。                            C01F 和 PCR-C10F 均能显著降低 t-BHP 诱导的细
               4 ℃、10 000 r/min，离心 5 min，取上清并用 BCA 试剂           胞 内 MDA 水 平（P<0.05），其 中 ，PCR-C10F 的
               盒测定蛋白浓度。根据目标蛋白分子质量大小选择                           MDA 水 平 显 著 低 于 Fresh-F 和 PCR-C01F（P<
               分离胶的浓度，先恒压 80 V 电泳至溴酚蓝指示剂在                       0.05）。结果表明，在 t-BHP 诱导的 HepG2 细胞氧化
               浓缩胶与分离胶交界处成线状，再改为恒压 120 V 至                      损伤作用下，PCR-CF能够有效改善细胞氧化应激损
               溴酚蓝到凝胶底部，约需90 min。电泳结束后进行转                       伤，从而发挥抗氧化作用，而且 PCR-C10F 抗氧化活
               膜，5% 脱脂奶粉的 TBST 中封闭 2 h，一抗 4 ℃孵育                 性较强。
               过夜，二抗室温孵育2 h，ECL显影并进行拍照。                             PCR-CF 中所含的黄酮类化合物可能是其发挥
                   7）数据统计与分析。试验至少有 3 个独立的平                      抗氧化活性的关键成分，为了进一步探究黄酮类化
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