Page 273 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
P. 273
第 5 期 杨泽南 等：液质联用法测定不同地域种植的“华墨香 5 号” 黑米中花青苷和酚酸类化合物含量 267
田种植，开花30 d后取成熟穗，保存于-20 ℃。 模 式 离 子 喷 雾 电 压 为 -4 500 V。 气 帘 气 为 0.24
1.2 样品前处理方法 MPa，雾化气为 0.38 MPa，干燥气为 0.41 MPa。源温
1）黑米粉的制备。将黑米穗脱粒后置于冷冻干 度为 550 ℃。质谱运行模式：多反应监测模式（multi-
燥机中充分冻干，砻谷机去壳后得到黑糙米，取 10 g reaction monitoring，MRM）。使用 Analyst 1.6.2 软件
黑 糙 米 置 于 全 自 动 组 织 研 磨 仪 中 研 磨（60 Hz， 处理数据。
2 min），将得到的黑糙米米粉过孔径 0.425 mm 筛，密 表1 流动相梯度
封后放于-20 ℃备用。 Table 1 The gradient of mobile phase
2）游离酚酸和花青苷的提取。参照文献［10-11］ 时间/min 流动相 A/% 流动相 B/%
Time Mobile phase A Mobile phase B
进行，略有改动。称取 50 mg 左右米粉样品于离心
0 95 5
管 A 中，加入 1 mL 纯 100% 甲醇超声抽提 30 min， 2 95 5
以 8 000 r/min 离心后吸取上清液置于 2 mL 离心管 24 0 100
B，再次加入 1 mL 70% 甲醇（pH=1）于离心管 A，重 27 0 100
30 95 5
复上述抽提步骤 1 次，上清液于离心管 B 中合并，再
用 OASIS HLB SPE 小柱与真空萃取装置中对样品 2 结果与分析
进行净化，将净化后的样品置于棕色进样瓶中，放
2.1 高效液相色谱分析方法的优化
于-80 ℃保存备用。汲取每份黑米待测物 20 μL，混
由于几种重要的酚酸类化合物存在同分异构
合后作为质控样品；以抽提液为空白对照。
体，对色谱分离有更高的要求。酚酸类化合物的色
1.3 仪器设备与试剂
谱流动相通常为甲醇-水和乙腈-水。本研究测试了
1）仪 器 设 备 。 高 压 液 相 色 谱 串 联 质 谱 仪
不同的流动相体系和添加剂，发现添加有 0.04% 乙
（HPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A
酸的乙腈-水体系分离效果良好。对 Poroshell 120
system；MS，AB SCIEX Triple Quad 5500）、UVF 超 EC-C18、GIST C18-AQ 和 VP-ODS C18 色谱柱进
声波清洗机（小美超声仪器昆山有限公司）、全自动 行比较，发现使用 GIST C18-AQ 色谱柱酚酸类化合
组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、真空萃 物的分离效果和峰型更好。本研究在色谱柱选用相
取装置（Sigma-Aldrich上海贸易有限公司）。 同填料的基础上使用 250 mm 的长柱，发现长柱分析
2）试剂。乙腈、乙酸（色谱纯，Sigma-Aldrich）。 时间加长但分离效果更佳（图 1），阿魏酸与异阿魏酸
OASIS HLB SPE 小柱（沃特世科技上海有限公司）。 得到了较好的分离。
香草酸、原儿茶酸、龙胆酸、阿魏酸、异阿魏酸、对香 2.2 质谱方法的优化
豆酸、丁香酸、咖啡酸、间苯三酚、芥子酸、水杨酸、 通过液质联用技术中的多反映监测模式，在正/
绿原酸、没食子酸、对羟基苯乙酸、2，4-二羟基苯甲 负离子模式下利用标准品逐个对 2 种花青苷和 15 种
酸、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）和芍药色素-3-O- 酚酸化合物进行扫描，确定 Q1 和 Q3，并优化各项电
离参数（表2），最终建立MRM检测方法。
葡 萄 糖 苷（P3G）标 准 品（TRC，艾 美 捷 科 技 有 限
2.3 花青苷和酚酸类代谢物提取条件的优化
公司）。
为比较不同地域黑米花青苷和酚酸类代谢物的
1.4 LC-MS/MS测定靶向代谢物
差异，采用酸水解法提取了可溶性糖苷型代谢物。
色谱柱为 Shim-pack GIST 3.0 μm C18-AQ 2.1
由于没有使用碱水解法，淀粉以沉淀形式存在，未发
mm× 250 mm（HSS），使用 VP-ODS C18 2.1 mm×
生糊化，非常适合使用固相萃取小柱进行纯化。固
150 mm 和 Poroshell 120 EC-C18 2.1 mm× 150 mm
相萃取法（HLB）纯化后的样品基质中的杂质大幅度
进行对比。 减少，有利于提高样品的信号强度。另外，黑米样品
色谱条件设定。流速 0.25 mL/min，柱温 40 ℃。 所富含的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡
流 动 相 A 为 水（0.25% 乙 酸），流 动 相 B 为 乙 腈 萄糖苷也会受到抽提过程的影响，其 C6-C3-C6 结
（0.25% 乙酸）。洗脱程序如表 1 所示。质谱元件参 构部分发生断裂生成酚酸类化合物，本研究选择在
数如下：正离子模式离子喷雾电压为5 500 V，负离子 pH=1的酸水解条件下提取30 min。
