Page 272 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第41卷 第5期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.41 No.5
2022年 9月 Journal of Huazhong Agricultural University Sep. 2022，266~272

杨泽南，张庆路，李凯凯，等 .液质联用法测定不同地域种植的“华墨香 5号”黑米中花青苷和酚酸类化合物含量［J］.华中农业大学学报，2022， 田种植，开花30 d后取成熟穗，保存于-20 ℃。 模 式 离 子 喷 雾 电 压 为 -4 500 V。 气 帘 气 为 0.24
41（5）：266⁃272.DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.05.032 1.2 样品前处理方法 MPa，雾化气为 0.38 MPa，干燥气为 0.41 MPa。源温
1）黑米粉的制备。将黑米穗脱粒后置于冷冻干 度为 550 ℃。质谱运行模式：多反应监测模式（multi-
液质联用法测定不同地域种植的“华墨香5号” 燥机中充分冻干，砻谷机去壳后得到黑糙米，取 10 g reaction monitoring，MRM）。使用 Analyst 1.6.2 软件

黑米中花青苷和酚酸类化合物含量 黑 糙 米 置 于 全 自 动 组 织 研 磨 仪 中 研 磨（60 Hz， 处理数据。
2 min），将得到的黑糙米米粉过孔径 0.425 mm 筛，密 表1 流动相梯度

杨泽南 ，张庆路 ，李凯凯 ，陈浩 2 封后放于-20 ℃备用。 Table 1 The gradient of mobile phase
2
1，2
1
2）游离酚酸和花青苷的提取。参照文献［10-11］
1.华中农业大学环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070；
进行，略有改动。称取 50 mg 左右米粉样品于离心
2.华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室，武汉 430070
管 A 中，加入 1 mL 纯 100% 甲醇超声抽提 30 min，
摘要 为研究不同种植地域对“华墨香 5 号”黑米中花青苷和酚酸类化合物含量的影响，在武汉、西安、陵 以 8 000 r/min 离心后吸取上清液置于 2 mL 离心管
水、宁波等 14 个地区种植了该黑米品种，通过高压液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）测定不同种植地域来源 B，再次加入 1 mL 70% 甲醇（pH=1）于离心管 A，重
的“华墨香 5号”样品中靶向代谢物，以外标法进行定量分析。结果显示，不同地域种植的“华墨香 5号”黑米中花 复上述抽提步骤 1 次，上清液于离心管 B 中合并，再
青苷和酚酸类化合物含量存在显著性差异，其中来自西安地区样品检出量最高，含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 用 OASIS HLB SPE 小柱与真空萃取装置中对样品 2 结果与分析
2.855 mg/g、芍药色素-3-O-葡萄糖苷 0.491 mg/g、原儿茶酸 0.088 mg/g；黄石地区样品检出量最低，分别为
进行净化，将净化后的样品置于棕色进样瓶中，放
0.865、0.162、0.048 mg/g。表明黑米中花青苷和酚酸类化合物积累显著受到种植环境影响，为生产高营养价值 2.1 高效液相色谱分析方法的优化
于-80 ℃保存备用。汲取每份黑米待测物 20 μL，混
黑米，需针对特定品种筛选合适的种植地域。 由于几种重要的酚酸类化合物存在同分异构
合后作为质控样品；以抽提液为空白对照。
关键词 “华墨香5号”黑米；花青苷；酚酸类化合物；地域差异；种植环境 体，对色谱分离有更高的要求。酚酸类化合物的色
中图分类号 S511；TS201.4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2022）05-0266-07 1.3 仪器设备与试剂 谱流动相通常为甲醇-水和乙腈-水。本研究测试了
1）仪 器 设 备 。 高 压 液 相 色 谱 串 联 质 谱 仪
不同的流动相体系和添加剂，发现添加有 0.04% 乙
随着生活水平的提升，人们对于主粮健康的作 邻近地理位置种植，而难以在不同地域广泛种植，因 （HPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A
酸的乙腈-水体系分离效果良好。对 Poroshell 120
用愈加关注。黑米是一种重要的有色稻米，“黑米主 此，对于特定黑米品种在不同地理环境下的营养物 system；MS，AB SCIEX Triple Quad 5500）、UVF 超 EC-C18、GIST C18-AQ 和 VP-ODS C18 色谱柱进
食化”不仅会大大提高人类的营养健康水平，还将减 质的定量比较分析较少见。“华墨香 5号”是华中农业 声波清洗机（小美超声仪器昆山有限公司）、全自动 行比较，发现使用 GIST C18-AQ 色谱柱酚酸类化合
轻对粮食需求的压力，保障粮食安全；同时还能有效 大学自主选育的黑米新品系，其稻米食味感官评价 组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、真空萃 物的分离效果和峰型更好。本研究在色谱柱选用相
减轻粮食生产对资源和环境的不良影响，促进农业 优良，直接蒸煮的黑米饭香润、软、弹、滑、甜，具有特 取装置（Sigma-Aldrich上海贸易有限公司）。 同填料的基础上使用 250 mm 的长柱，发现长柱分析
［1］
绿色发展 。。近些年，我国科学家逐步培育出多种口 殊香气。本研究在国内不同地域种植黑米品种“华 2）试剂。乙腈、乙酸（色谱纯，Sigma-Aldrich）。 时间加长但分离效果更佳（图 1），阿魏酸与异阿魏酸
感食味俱佳的黑米品种。黑米籽粒的成熟过程中， 墨香 5 号”，对不同地域“华墨香 5 号”的花青苷含量 OASIS HLB SPE 小柱（沃特世科技上海有限公司）。 得到了较好的分离。
花青苷在果皮大量积累，故呈现紫黑色。黑米中最 和酚酸类化合物进行比较，探究地域差异对“华墨香 香草酸、原儿茶酸、龙胆酸、阿魏酸、异阿魏酸、对香 2.2 质谱方法的优化
主要的花青苷是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药色 5 号”花青苷和酚酸含量的影响，以期为其适宜的产 豆酸、丁香酸、咖啡酸、间苯三酚、芥子酸、水杨酸、 通过液质联用技术中的多反映监测模式，在正/
素-3-O-葡萄糖苷。果蝇喂饲试验证明，黑米具有延 业化种植提供依据。 绿原酸、没食子酸、对羟基苯乙酸、2，4-二羟基苯甲 负离子模式下利用标准品逐个对 2 种花青苷和 15 种
［2］
长寿命的功效 。除了肉眼看得见的“健康”成分外， 1 材料与方法 酸、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）和芍药色素-3-O- 酚酸化合物进行扫描，确定 Q1 和 Q3，并优化各项电
黑米还有许多看不见的“健康”成分，如酚酸类化合 离参数（表2），最终建立MRM检测方法。
葡 萄 糖 苷（P3G）标 准 品（TRC，艾 美 捷 科 技 有 限
物，其和花青苷一样都具有显著的健康效益 ［3-4］ 。在 1.1 试验材料 2.3 花青苷和酚酸类代谢物提取条件的优化
公司）。
黑米中含量最高的酚酸类化合物是原儿茶酸（proto⁃ 供试品种为黑米品种“华墨香 5 号”。试验于 为比较不同地域黑米花青苷和酚酸类代谢物的
1.4 LC-MS/MS测定靶向代谢物
catechuic acid），具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗癌、抗 2021 年夏季在湖北省武汉市（华中农业大学）、潜江 差异，采用酸水解法提取了可溶性糖苷型代谢物。
色谱柱为 Shim-pack GIST 3.0 μm C18-AQ 2.1
炎等的多种生理功能 ［5-7］ 。因此，酚酸类化合物含量的 市、襄阳市南漳县、襄阳市高新区、荆门市东宝区、石 由于没有使用碱水解法，淀粉以沉淀形式存在，未发
mm× 250 mm（HSS），使用 VP-ODS C18 2.1 mm×
高低也是影响黑米健康效应的重要因素。 首市高基庙镇、监利市红城乡、咸宁市赤壁市、黄冈 生糊化，非常适合使用固相萃取小柱进行纯化。固
150 mm 和 Poroshell 120 EC-C18 2.1 mm× 150 mm
现已有较多对黑米的农艺性状、食味品质、营养 市罗田县、黄石市阳新县，浙江省宁波市慈溪市，陕 相萃取法（HLB）纯化后的样品基质中的杂质大幅度
进行对比。
物质的研究报道 ［8-9］ 。通常特定黑米品种仅在 2~3 西省西安市、汉中市，海南省陵水县 14个地区进行大 减少，有利于提高样品的信号强度。另外，黑米样品
色谱条件设定。流速 0.25 mL/min，柱温 40 ℃。 所富含的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡
收稿日期：2022-05-11 流 动 相 A 为 水（0.25% 乙 酸），流 动 相 B 为 乙 腈 萄糖苷也会受到抽提过程的影响，其 C6-C3-C6 结
基金项目：华中农业大学环境食品学教育部重点实验室专项（2662021SPPY002）
（0.25% 乙酸）。洗脱程序如表 1 所示。质谱元件参 构部分发生断裂生成酚酸类化合物，本研究选择在
杨泽南，E-mail：yzn@webmail.hzau.edu.cn
通信作者：陈浩，E-mail：hchen@mail.hzau.edu.cn 数如下：正离子模式离子喷雾电压为5 500 V，负离子 pH=1的酸水解条件下提取30 min。