Page 177 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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第 5 期                  闫佳兴 等：石金钱龟板来源的寡肽与环氧合酶-2 相互作用机制                                     171

               象的影响    ［24-25］ 。按照本文“1.4”的方法制备 COX-2            1.9  数据统计与分析
               溶液与 KNGP 溶液。在室温条件下，将样品稀释至                            本试验每组数据均做平行重复试验 3 次，以“平
               200 倍后，以 200 nm 为起始激发波长，200~500 nm               均值±标准差”表示。利用 SPSS 17.0软件进行显著
               为连续扫描记录发射波长，狭缝宽度设定为 5 nm，扫                       性分析，P<0.05 为差异显著。采用 Origin 8.0、Dis⁃
               描速度设定为 1 200 nm/min，电压设定为 700 V。所                covery Studio 2019 等 软 件 绘 图 与 荧 光 光 谱 数 据
               有测定均重复3次。                                        分析。
               1.7  表面疏水性的测定                                    2   结果与分析
                   8-苯胺基萘-1-磺酸（8-anilino naphthalene-1-sul⁃
                                                                2.1  不同样品的IC 50 值分析
               fonic acid，ANS）是一种疏水性探针，能在与蛋白质
                                                                    3 种寡肽样品（石金钱龟板肽 YPTP、合成肽段
               的表面疏水基团相互反应时，增强其荧光光度值，可
                                                                KNGP 和 RG 样品）对于 COX-2 的抑制率如图 1 所
               以常用来反映表面疏水性的变化               ［26］ 。表面疏水性的
                                                                示，由非线性回归分析得到 3种寡肽样品和阳性药布
               变化通常反映酶的构象变化             ［27］ 。将按照本文“1.4”
                                                                洛芬的 IC 50 值，分别为 0.609、0.046、0.056 和 0.217
               方法制备的 COX-2 溶液与 KNGP 溶液，混合均匀后
                                                                mg/mL。其大小排序为 KNGP<RG <阳性药布洛
               静置 10 min，加入 10 μL 的 0.10 mmol/L 的 ANS 溶
                                                                芬<石金钱龟板肽 YPTP（72.16%）。这些样品中
               液，在 298 K 下避光 20 min。设定激发波长 390 nm，
                                                                KNGP 的 IC 50 值最小，表明 KNGP 对 COX-2 具有极
               发射波长 420~570 nm，激发狭缝 5.0 nm 和发射狭缝
                                                                显著的抑制潜力。因此，选用 KNGP 进行后续的荧
               2.5 nm。分别以相对应的 KNGP-缓冲溶液体系的荧
                                                                光光谱试验，探究肽段KNGP对COX-2的抑制机制。
               光 发 射 光 谱 作 为 空 白 背 景 信 号 。 所 有 测 定 均 重
                                                                2.2  内源荧光光谱分析
               复3次。
                                                                    1）荧光猝灭分析。图 2 所示为 KNGP 与 COX-2
               1.8  分子对接                                        在 298 K 下的荧光发射光谱。随着 KNGP 浓度的增
                   分子模拟对接是研究分子之间特别是生物分子                         加，COX-2的荧光强度减小，表明COX-2发生荧光猝
               复合物（如药物与受体）之间相互作用的一种有效方                          灭现象。从而表明 KNGP与 COX-2之间发生了相互
               法，它能获得配体和受体结合构象、位点和作用力等                          作用，使得酶的微环境发生了变化。如图 3 所示，在
               信息  ［28］ 。本研究分子对接过程和结果分析均采用                      不同温度（298、304、310 K）下拟合的曲线为线性，表
               Discovery Studio 2018 软件进行。COX-2（PDB ID： 明由 KNGP 造成 COX-2 的荧光猝灭类型是单一的。
               3NT1）的晶体结构取自 Protein Data Bank 蛋白质数              如 表 1 所 示 ，由 斜 率 可 计 算 出 K q 值 ，YPTP 对 于
               据库，KNGP肽段的结构由 ChemDraw 7.0，软件绘制                  COX-2的不同温度的K q 值分别远大于最大扩散碰撞
                                                                                10
               好的结构导入 Discovery Studio 2018 软件中，利用              猝灭常数［2.0×10 L/（mol∙s）］，呈现出静态猝灭的
               Small Molecules 模块下 Prepare Ligands 工具处理。        特征；同时，随着温度升高（298、304 和 310 K）导致
                                                                KNGP-COX-2 复合物的猝灭常数（K sv ）降低（分别为
               分别利用 Discovery Studio 2018 对 COX-2 进行去水
                                                                2.09×10 、1.51×10 和 1.31×10 L/mol），即温度越
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               与加全氢等预处理。分子对接结果的ROC曲线图可
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               以分析分子对接的打分函数，X 轴越接近零，准确率
                                                                YPTP对COX-2的荧光猝灭方式为静态猝灭。
               越高；Y轴越大代表准确率越好。曲线越接近左上角
                                                                    2）结合常数和结合位点。如图 4 所示，lg［（F 0 -
              （X 越小，Y 越大），即曲线下面积越大，预测准确率越
                                                                F）/F］与 lg［Q］拟合的 298、304 和 310 K 温度下的双
               高 ［29］ 。基于与参考文献［30］对比结合酶的配体位置
                                                                对数回归曲线是线性的。不同温度下计算结果见表
               获 得 对 接 位 点 的 信 息 。 COX-2 的 活 性 位 点 由            2。不同温度下 COX-2的 n值接近 1，这意味着 COX-
               Arg120、Glu524 和 Tyr355 三个氨基酸残基组成，活               2 上仅存在单一结合位点供 KNGP 结合。此外，
               性位点周围还包括有一些氨基酸残基如：Lys83、                         COX-2 和 KNGP 在不同温度下的 K a 值分别为 4.3×
               Tyr115、Ser119、Val89、Pro86、Leu93、Leu123 ［31］ 。随   10 、7.5×10 和 12.5×10 L/mol。随着温度升高，配
                                                                  4
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               后利用 CDOCKER 对接方法对接，其他参数采取默                       合物 K a 值变大，这反映出 KNGP 和 COX-2 相互作用
               认值，根据结合能大小对结果进行排序和可视化                            的稳定性升高。
               分析。                                                  3）热 力 学 参 数 特 征 。 表 3 列 出 了 KNGP 和
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