Page 176 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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               tides，YPTP）（肽含量 72.16%）由笔者所在研究团队                 1.4  内源荧光光谱测定
               前期制备    ［10］ ，试验中所使用石金钱龟板的肽段 Lys-                    蛋白质中由于氨基酸残基色氨酸（Trp）、酪氨酸
               Asn-Gly-Pro（KNGP）和 Arg-Gly（RG）的结构为团队 （Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在而具有内源荧光                            ［14］ ，
               前期鉴定    ［10］ ，由生工生物工程（上海）股份有限公司                  进行荧光猝灭试验可以获得 KNGP与 COX-2之间的
               合成，纯度大于98%。                                      结合机制、结合位点、结合力和热力学参数等相互作
                   2）试剂。试验中所使用的试剂均为分析纯，所                        用的特征   ［15-16］ 。使用 Stern-Volmer 方程分析荧光猝
               使用水为去离子水。COX-2（美国 Sigma-Aldrich 公                灭数据，以研究其猝灭类型           ［17-18］ 。
               司），8-苯胺基萘-1-磺酸（美国 Sigma-Aldrich 公司），                 基于 KNGP 对 COX-2 是静态猝灭的结果，我们
               花生四烯酸（AA，上海阿拉丁生化科技股份有限公                          假设 KNGP 能与 COX-2 的活性位点结合形成配体-
               司），N，N，N，N-四甲基对苯二胺盐酸盐（TMPD，上                     蛋白质的基态配合物，根据文献［17-18］中的公式计
               海源叶生物科技股份有限公司），正铁血红素（Hema⁃                       算配合物的结合位点数（n）和表观结合常数（K a ），K a
                                                                值越大，配合物的紧密程度和稳定性越强                 ［17-18］ 。
               tin，猪，美国 Sigma-Aldrich 公司），Tris（北京兰杰柯
                                                                    荧 光 猝 灭 分 为 静 态 猝 灭 和 动 态 猝 灭 2 种 方
               科技有限公司），氢氧化钾和二甲基亚砜（国药集团
                                                                式 ［19-20］ 。当猝灭类型是静态猝灭时，KNGP 与 COX-
               化学试剂有限公司）。
                                                                2 的结合过程依赖于静电相互作用、氢键、疏水相互
               1.2  仪器与设备
                                                                作用和范德华力等。根据上述 3 个温度下的 K a 值，
                   KNGP 的 结 构 用 ChemDraw 7.0 软 件 绘 制 。
                                                                采用 Van't Hoff 方程求得焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和自
               KNGP 与 COX-2 的分子对接选择 Discovery Studio
                                                                            ［21］
                                                                由能变化（ΔG） 。
               2018 软件（华中农业大学农业微生物学国家重点实
                                                                    当 ΔH<0、ΔS<0 时，主要驱动作用是氢键；当
               验室）。紫外可见分光光度计（日本岛津公司），荧光
                                                                ΔH>0、ΔS>0时，主要驱动作用是疏水相互作用；当
               光谱仪F-4600（日本Jasco公司）。
                                                                ΔH<0、ΔS>0 时，主要驱动作用是静电作用                 ［22-23］ 。
               1.3  IC 50 值的测定
                                                                在 200 μL 的反应体系中，加入 150 μL 溶解于 Tris-
                   根据 Shang 等  ［12］ 和曹艳花等   ［13］ 报道的方法进行
                                                                HCl 缓冲液（pH 7.8）的 COX-2（10 U/mL），之 后分
               适当的修改。首先，用 0.1 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液
                                                                别逐次加入 50 μL 的 IC 50 值最低的肽段（KNGP）溶
              （pH 7.8）将 COX-2稀释制成 25 U/mL 溶液。设置样                液，分别控制终浓度为 0.00~0.50 mmol/L。然后采
               品组、样品对照组、空白对照组和空白背景组，样品                          用 F-4600 荧光光谱仪测定各样品的内源荧光光谱。
               对照组是以缓冲溶液代替样品溶液，空白对照组是                           其 中 ，设 置 激 发 波 长 280 nm，发 射 波 长 350~500
               以缓冲溶液代替酶，空白背景组以缓冲溶液代替样                           nm，狭缝宽度设定为 5 nm，扫描速度设定为 1 200
               品和酶。将 140 μL 的缓冲溶液、20 μL 的 COX-2 溶               nm/min，电压设定为700 V。所有测定均重复3次。
               液、10 μL Hematin（2.5%）分别与不同浓度的样品混                 1.5  同步荧光光谱测定
               合均匀，在 25 ℃下孵化 5 min。随后，添加 10 μL 的                    当同步荧光的波长间隔（Δλ）设置为 15 和 60 nm
               21 μmol/L 的 N，N，N，N-四甲基对苯二胺盐酸盐                   时，可以分析 COX-2 中的酪氨酸和色氨酸残基的光
              （TMPD）和 100 μmol/L 花生四烯酸（AA）来启动反                  谱变化，从而阐明 COX-2 的构象变化            ［24］ 。按照本文

               应。在 25 ℃下反应 20 min 后，使用紫外可见分光光 “1.4”的试验方法（溶液的量与浓度相同）在 298 K 下
               度计在 590 nm 处记录吸光度值。所有试验重复 3                      进行同步荧光光谱的测定。分别设定 Δλ=15 nm 和
               次。用式（1）计算抑制率：                                    Δλ=60 nm，狭缝宽度设定为 5 nm，扫描速度设定为
                             (   D sample - D sampleblank )     1 200 nm/min，电压设定为 700 V，进行同步荧光光
                     抑制率 = 1 -                  × 100%    （1）
                                 D control - D controlblank     谱扫描。所有测定均重复3次。
                                                                    采用文献［25］中的公式计算 KNGP对 COX-2的
                   式中，D control 是空白对照组的吸光度；D controlblank
               是空白背景组的吸光度；D sample 是样品组的吸光度； 同 步 荧 光 猝 灭 率（ratio of synchronous fluorescence
               D sampleblank 是 样 品 对 照 组 的 吸 光 度 。 最 后 ，利 用     quenching，RSFQ）。
               SPSS 26.0 对得到的数据进行非线性回归分析得到                      1.6  三维荧光光谱测定
               半数抑制浓度（IC 50 ）值。                                     利用三维荧光光谱可以分析 KNGP对 COX-2构
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