Page 222 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
P. 222

216                                华 中 农 业 大 学 学 报                                    第 41 卷

               于Solarbio（中国北京）。                                 保温 20 min），振荡均匀，50 ℃水浴 30 min，加入 0.75
               1.2  培养基                                         mL 的 DNS 终止反应，沸水浴 5 min 显色。用冰水冷
                   1）富集培养基。A 液：胶体壳聚糖 1%、pH 5.5~                 却至室温，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液 1 mL，
                                                                加入微量比色皿，测定 540 nm 下 OD 值。以等量煮
               6.0；B 液：KH 2 PO 4 0.2%、酵母粉 0.2%、无水 MgSO 4
               0.1%、NaCl 1%、（NH 4 ） 2 SO 4 1%。                  沸灭活的酶液作空白对照。根据氨基葡萄糖盐酸盐
                   2）液体发酵培养基。A 液：胶体壳聚糖溶液                        标准曲线，计算出还原糖的量，换算壳聚糖酶的酶活
                                                                力（酶活性）。
               1%、pH 5.5~6.0；B 液 ：KH 2 PO 4 0.22%、Na 2 HPO 4
                                                                    酶活力单位定义：在上述条件下，每毫升粗酶液
               0.1%、KCl 0.15%、MgSO 4 •7H 2 O 0.15%、CaCl 2
               0.02%、NH 4 Cl 0.5%、酵母浸粉0.3%。                     每分钟产生 1 μmoL 还原糖（以氨基葡萄糖计算）所
                   3）初筛培养基。在液体发酵培养基的基础上添                        需的酶量为 1 个酶活力单位（U）。相对酶活力是以
               加2%琼脂。                                           同组试验的最高酶活力为 100%，其他酶活力与最高
                                                                            ［5］
                   4）固体发酵培养基。在液体发酵培养基的基础上                       酶活力的比值 。剩余酶活力是经过一定处理后的
               添加：麸皮0.8%、豆粕0.8%；A液10 mL、B液20 mL。                酶活力与原来的酶活力的比值。
               1.3  菌株的分离筛选                                         按照 Brad-ford 法，以牛血清白蛋白作为标准蛋
                   称取土壤样品 10 g，加 90 mL 无菌生理盐水，搅                 白样品，测定蛋白质含量。
               拌土壤悬浮液。吸取上层清液5 mL至50 mL富集培                       1.7  产壳聚糖酶的固体发酵工艺的单因素试验和
                                            -1
               养基中，培养 2 d。富集液进行 10 ~10            -7 梯度稀释， 正交试验设计
               分别取 3 个连续梯度稀释液 0.1 mL 至初筛培养基平                        除了豆粕和麸皮、酵母浸粉，分别采用不同碳
               板，培养 3~5 d。观察是否有透明圈产生，记录测量                       源：1% 胶体壳聚糖+1% 葡萄糖、1% 胶体壳聚糖+
               透明圈直径（D）以及菌落直径（d）大小，计算D/d值。 1% 蔗糖、1% 胶体壳聚糖+1% 淀粉、1% 胶体壳聚
               将产生透明圈的菌株进行平板划线培养，菌株接入                           糖、1% 粉末壳聚糖、1% 胶体几丁质、1% 粉末几丁
               50 mL 液体发酵培养基的三角瓶中，180 r/min、37 ℃                质、1% 葡萄糖、1% 蔗糖、1% 淀粉，考察碳源对菌株
               培养 3 d。取发酵液在 4 ℃下 10 000 r/min 离心 10             发酵产酶的影响。
               min，收集上清液，用 DNS 法测定上清液中壳聚糖酶                          在最佳碳源下分别添加相同质量的不同氮源
               的活力，将壳聚糖酶活力较高的菌株保存并鉴定。                          （NH 4 Cl、（NH 4 ） 2 SO 4 、NaNO 3 、蛋白胨和牛肉膏），不
               1.4  固态发酵粗酶液的制备                                  同比例的麸皮和豆粕（14∶2、12∶4、10∶6、8∶8、6∶10、
                   取灭菌好的固体发酵培养基，加入 10 mL 灭菌                     4∶12、2∶14），不同接种量的液体发酵液（1、2、3、4、
               营养液、20 mL 1% 胶体壳聚糖和 3 mL 液体发酵液， 5 mL），按照不同发酵时间（3、4、5、6、7 d），设置不同
               37 ℃培养 4 d。取培养好的固体曲，加入 120 mL 0.2                起始 pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），不同温度（27、
               moL/L 醋酸缓冲液（pH 5.6），粉碎，4 ℃低速搅拌                   32、37、42、47 ℃），分别研究各因素对菌株产壳聚糖
               2 h。经多层纱布过滤，滤液于 4 ℃下 10 000 r/min 离              酶活力的影响，以确定各单因素的最佳参数。在单
               心10 min，收集上层清液为粗酶液，4 ℃冰箱内保存。                     因素试验基础上，选取固体发酵的温度、时间、起始
               1.5  菌株形态学和分子生物学的鉴定                              pH，设计三因素三水平的L 9 （3 ）正交试验。
                                                                                          3
                   肉眼观察菌株的菌落形态、颜色等。采用插片                         1.8  壳聚糖酶的纯化
               法培养真菌，乳酸石炭酸棉蓝染料染色 15 min 制片，                         将发酵浸提的粗酶液缓慢搅拌加入干燥的硫酸
               显微镜下观察，进行初步鉴定。菌株送到生工生物                           铵固体粉末，达到 80% 的饱和度，冰水浴 30 min，4 ℃
               工程（上海）股份有限公司进行 18S rDNA 序列测序， 下 10 000 r/min 离 心 10 min，收 集 沉 淀                     ［6］ 。 用 0.2
               结合NCBI数据库建立系统发育树，进行菌株鉴定。                         mol/L、pH 5.6 的 HAc-NaAc 缓冲液溶解，透析过夜。
               1.6  壳聚糖酶活力及蛋白质含量的测定                             上载到 Q SFF 离子交换柱，采用 20 mmol/L pH 7.2
                               ［4］
                   根据张馨月等 的方法，从粗酶液中取出部分稀                        磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，测定酶活力。
               释，4 ℃下 10 000 r/min 离心 10 min。取上层清液              1.9  SDS-PAGE电泳、酶谱和生物质谱分析
               0.15 mL，加入含 0.45 mL 1% 胶体壳聚糖及 0.4 mL                 采 用 12% 分 离 胶 和 5% 的 浓 缩 胶 进 行 SDS-
               醋酸缓冲液（pH 5.6）的试管中（试管提前 50 ℃水浴                    PAGE 电泳，考马斯亮蓝 G-250 染色观察目标蛋白
   217   218   219   220   221   222   223   224   225   226   227