Page 223 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第 5 期 姚炎 等：溜曲霉 M3b 产壳聚糖酶的固体发酵工艺优化及酶学性质 217

质，并使用蛋白质 Marked 试剂盒（Solarbio，中国北 表1 产壳聚糖酶菌株的生物降解能力
京）分析该壳聚糖酶的分子质量。酶谱分析参照本实 Table 1 Biodegradation of the
［4］
验室之前的研究 ，在电泳分离胶中加入 100 mg/L chitosanase-producing strains
乙二醇壳聚糖进行酶谱分析。将分离胶放置在紫外 透明圈直径/cm 菌落直径/cm 酶活力/
菌株 （U/mL）
灯下观察，壳聚糖酶活性带显示为蓝色暗带。 Diameter of Colony D/d
Strain Enzyme
蛋白进行 SDS-PAGE 后采用电喷雾-四级杆-飞 transparent ring diameter activity
行时间串联质谱（ESI-Q-TOF2）鉴定蛋白质肽段序 M3b 4.2 2.8 1.5 8.32±0.13
［7］
列 ，通过 Peptide sequencing 软件分析得到 3 个肽段 HZAU.11 3.9 2.9 1.3 5.28±0.05
X3 1.9 1.4 1.4 6.34±0.07
序列，将肽段序列在NCBI数据库中进行比对分析。
B3b 4.5 3.4 1.3 6.54±0.06
1.10 壳聚糖酶AtChito40的酶活力测定
M7a 3.6 3.0 1.2 5.90±0.06
采 用 乙 酸 -乙 酸 钠（pH 3.0~6.0）、NaH 2 PO 4 - D2a 3.5 2.5 1.4 7.02±0.09
Na 2 HPO 4 （pH 6.0~7.5）、Tris-HCl（pH 7.5~9.0）、甘氨 2.2 菌株M3b的鉴定
酸-氢氧化钠（pH 9.0~10.0）缓冲液体系（50 mmol/L） 菌株 M3b 菌落形态和透明圈大小如图 1A 所示，
溶解底物，将纯酶液适当稀释，测定壳聚糖酶活力， 可见菌落结构较疏松，中部呈絮状，菌落中心呈暗黄
以壳聚糖酶活力最大值为 100%，确定最适反应 pH。 绿色。由图 1B 油镜镜检结果可知，分生孢子头呈球
考察酶的 pH 稳定性，将壳聚糖酶在 pH 3.0~10.0 处 形，分生孢子梗大多有隔，顶囊近球形至烧瓶形，产
理 30 min，在标准条件下测定剩余酶活力。在最适 孢结构双层，梗基有足细胞，分生孢子较大，多为近
pH下，不同温度（30~90 ℃）测定酶活力，以最大壳聚 球形和卵圆形。有单层梗基由乳酸石炭酸棉蓝染成
糖酶活力值为 100%，分别计算各温度下的相对酶 浅蓝色，因此，将菌株M3b归为曲霉属。
［8］
活 。将壳聚糖酶液置于不同温度（30~90 ℃）水浴
保温 30 min，放入冰水浴中冷却 30 min。按上述方法
［9］
在最适温度和最适pH条件下测定剩余酶活力 。
1.11 壳聚糖酶AtChito40水解壳聚糖试验
壳聚糖酶与 1% 胶体壳聚糖在 50 ℃下搅拌 8 h
进行水解反应，不同时间点取样，煮沸 20 min 后灭
活 ，12 000 r/min 离心 10 min，取上层清液，经 0.22
图1 M3b菌株的菌落特征（A）和孢子结构的
μm 滤膜过滤。采用用薄层层析法（TLC）分析壳聚 油镜图（100 ✕）（B）
糖酶液的降解产物 ［10］ 。展开剂配方为正丁醇∶冰醋 Fig. 1 The colony characteristics（A）and oil immersion
酸∶水∶氨水=10∶5∶5∶1（体积比），显色剂配方为硫 lens picture of spore structure（100 ✕）of M3b（B）
酸∶甲醇=1∶9（体积比）。 菌株 M3b 测序结果显示 18S rDNA 序列长度为
1.12 数据处理与分析 1 298 bp，通过 GenBank 数据库的序列比对，构建系
本试验所有样品均重复测定 3 次，取平均值，采 统发育进化树（图 2）。相似度比较结果显示，菌株
用 Excel 2016 软件进行数据处理，用 Origin 2018 软 M3b与溜曲霉（Aspergillus tamarii）的同源关系最近，
件进行绘图。 相似度最高（99%）。因此，确定菌株M3b为溜曲霉。
2 结果与分析 2.3 产酶条件的优化
由图 3A 可知，添加胶体壳聚糖和葡萄糖溜曲霉
2.1 产壳聚糖酶菌株的筛选 菌株 M3b 产壳聚糖酶活力最高为 10.3 U/mL，其次
通过富集培养，利用胶体壳聚糖作为唯一碳源 是添加胶体壳聚糖（9.29 U/mL）、胶体壳聚糖和蔗糖

筛选和分离产壳聚糖酶的菌株，分别测量透明圈和 （9.30 U/mL）、胶体壳聚糖和淀粉（9.32 U/mL），而
菌落的直径，计算两者的比值，初步判定菌株降解能 添加淀粉、葡萄糖、蔗糖时，菌株M3b产酶活力最低。
力大小，测定结果见表 1，可见菌株 M3b比值最大，且 如图 3B所示，当添加（NH 4 ） 2 SO 4 为氮源时，菌株
产壳聚糖酶能力较强，初始酶活力达到11.60 U/mL， M3b 所产酶活力最高，为 11.99 U/mL。其他依次为
产酶稳定。因此，选取菌株M3b进行后续研究。 NH 4 Cl（10.77 U/mL）、NaNO 3 （7.97 U/mL）。