Page 225 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第 5 期 姚炎 等：溜曲霉 M3b 产壳聚糖酶的固体发酵工艺优化及酶学性质 219

色，由于营养消耗以及菌株代谢产物积累，测定的壳
聚糖酶活力和蛋白含量开始下降。

M：170 Marker；1：固体发酵粗酶液；2：硫酸铵沉淀；3：纯酶液；
4：壳聚糖酶酶谱。M ：170 Marker；1：Solid fermentation crude en⁃
zyme solution；2：Ammonium sulfate precipitation；3：Purified AtChi⁃
to40；4：Enzymogram of chitosanase.
图4 培养时间对溜曲霉M3b产壳聚糖酶的影响
图5 溜曲霉M3b菌株产壳聚糖酶纯化的
Fig. 4 Effect of fermentation time on chitosanase SDS-PAGE电泳图谱
production by Aspergillus tamarii M3b
Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of chitosanase
正交试验结果发现，发酵时间对于酶活力的影 purified from Aspergillus tamarii M3b strain
响最大，其次是发酵温度、起始pH。最优组合为发酵
Pd1（gi 953382223）壳聚糖酶对应的氨基酸残基肽段
温度 32 ℃、起始 pH 7.0、发酵时间 6 d，此条件下进行
序列同源性为 100%。而肽段 EVTGEASWLMAR
发酵，产酶活力达到20.56 U/mL，是初始固体发酵培
与 Aspergillus nidulans FGSC A4（gi 259480859）、As⁃
养的221.3%。
pergillus fumigatus Af293（gi 146223521）以及 Micro⁃
2.4 壳聚糖酶AtChito40的纯化
cystis aeruginosa（gi 754187083）来源的壳聚糖酶肽段
固体发酵培养基经缓冲液浸提的粗酶液，经硫
序列同源性为 100%。肽段 EVTGEASWLMAR 则
酸铵沉淀、QSFF 阴离子交换层析纯化后得到电泳单
与 Penicillium oxalicum 114-2（gi 146323521）、Asper⁃
一带。图 5 显示酶谱中仅出现 1 条暗带，说明该菌株
gillus nidulans FGSC A4（gi 259480859）和 Aspergil⁃
产生的壳聚糖酶只有 1 种，对应蛋白的分子质量为
lus fumigatus Af293（gi 146323521）等来源的壳聚糖
40 ku。通过 SDS-PAGE 电泳图和酶谱分析，发现该
酶氨基酸残基肽段序列同源性达 100%。结合以上
壳聚糖酶达到电泳级纯度，并将蛋白命名为 AtChi⁃
的纯化过程和结果，可以证明该蛋白为壳聚糖酶。
to40。
蛋白纯化结果（表 2）显示，该壳聚糖酶酶活回收 值得注意的是，质谱显示的其他众多片段在数据库
率为27.5%，纯化倍数为10.7倍。 中 与 其 他 蛋 白 质 序 列 比 对 的 同 源 性 较 低 ，表 明
2.5 壳聚糖酶AtChito40质谱鉴定 AtChito40可能较为新颖。

在 NCBI 数据库中 3 个肽段分别都存在同源性 2.6 pH 和温度对壳聚糖酶 AtChito40 活性和稳定
为 100% 的壳聚糖酶肽段。肽段 MDVDCDG 与 As⁃ 性的影响
pergillus nidulans FGSC A4（gi 259480859）、Asper⁃ 菌株 M3b 产壳聚糖酶的最适温度结果见图 6A，
gillus niger（gi 966763517）及 Penicillium digitatum 最适温度为 60 ℃，但该酶在 60 ℃保温 30 min，剩余酶

表2 溜曲霉M3b壳聚糖酶的纯化结果
Table 2 Purification of chitosanase from Aspergillus tamarii M3b

纯化步骤 总酶活/U 蛋白含量/mg 比酶活/（U/mg） 纯化倍数 回收率/%
Purification step Total activity Protein Specific activity Purification fold Recovery
粗酶液 Crude culture 1 868.60 988.01 1.89 1.00 100
硫酸铵沉淀
1 297.10 541.20 2.40 1.24 69.42
Ammonium sulfate precipitation
Q-SFF阴离子交换柱
513.80 25.33 20.30 10.70 27.50
Q-Sepharose fast flow