Page 159 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第 5 期 胡海娟 等：基于胆固醇外排、摄取与合成的柑橘果胶胶寡糖调控胆固醇代谢机制 153

进而减少巨噬细胞氧化型 LDL 的摄取和胆固醇沉 光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；Thermofish⁃
积，使巨噬细胞的泡沫化得到延缓 ［9］ 。尿石素 A 在 er Veriti 96 梯度 PCR 仪，美国应用生物系统公司；
显著上调 ABCA1和 ABCG1基因的表达来促进胆固 NanoDrop 微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific
醇 排 出 的 同 时 能 够 抑 制 巨 噬 细 胆 固 醇 合 成 酶 公司；Anaerobox IV 厌氧培养箱，美国 GENE SCI⁃
HMGCR 的转录和翻译，从而减少胆固醇在巨噬细 ENCE 公司 ；DYY-6C 电泳槽 ，北京六一仪器厂 ；
胞的沉积 ［10］ 。 TGL-16 高 速 离 心 机 ，苏 州 雨 泽 仪 器 有 限 公 司 ；
笔者所在团队前期研究发现，柑橘果胶寡糖 H1 SMR16.1 酶标仪，优尔生生命科学装备有限公司；
（POS H1 ）作为一种可以被肠道菌群水解利用的水溶 AX-Ⅱ暗匣，广东粤华医疗器械厂有限公司。
性膳食纤维，其对高脂膳食小鼠胆固醇水平具有明 1.2 POS H1 体外培养肠道菌群
显的改善效果，且 POS H1 发挥调控胆固醇代谢作用 液体 LB 培养基配方：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提
与胆固醇排出和合成密切相关 ［11］ ，但具体机制还未 取物、5 g氯化钠，1 mol/L NaOH调pH至7.4，去离子
见研究报道。因此，本研究采用巨噬细胞模型研究 水定容至 1 L，高压灭菌备用。POS H1 培养基：每 100
POS H1 及其肠道菌群发酵产物对胆固醇排出、摄取以 mL液体LB培养基加入5 g POS H1 。
及合成功能的影响与机制，旨在为揭示 POS H1 的降 POS H1 体外培养：粪便接种液是将 10 人粪便经
胆固醇机制提供理论依据。 0.01 mol/L 灭菌 PBS 缓冲液稀释为 0.1 g/mL 的粪便

1 材料与方法 悬浮液，由瑞典卡罗林斯卡医学院 Clinical Microbiol⁃
ogy 系的 Christian G. Giske 教授实验室提供。将该
1.1 试验材料 接种液按 1%（V/V）接种到 POS H1 培养基中，37.0 °C
1）试验原料。本研究所用原料为实验室自制的 厌氧培养 24 h，对照组为不加 POS H1 的 LB 液体培养
柑橘果胶寡糖级分 H1（以下均简称为 POS H1 ），由过 基。24 h 后，4 °C、4 000 r/min 离心 10 min 取上清液
氧化氢高温水解柑橘皮果胶所得，方法见文献［12］。 收集，该上清液即为肠道菌群发酵产物。对照组的
THP-1 细胞由卡罗林斯卡医学院 Division of Clinical 肠道菌群发酵产物记为 N24，POS H1 组的肠道菌群发
Chemistry提供。粪便接种液由瑞典卡罗林斯卡医学 酵产物记为 P24。上清液过 0.22 μm 滤膜后，−80 °C
院 Clinical Microbiology 系 Christian G. Giske 教授实 储存待用。
验室提供。 1.3 THP-1细胞复苏与培养
2）主要试剂。Gibco RPMI 1640 培养基、Gibco 取出−80 ℃冰箱冻存的细胞，将其于 37 ℃恒温
胎 牛 血 清 、High capacity cDNA 反 转 录 试 剂 盒 、 水浴锅融化。随后，转移至 15 mL 无菌离心管离心；
SYBR Green Master mix、LPS、蛋白 Marker 和蛋白 再加 入 8 mL 含 10% FBS、1% 10 U/mL 青 霉 素
酶 抑 制 剂 均 购 于 Thermo Fisher Scientific 公 司 。 和 10 mg/mL 链 霉 素 混 合 液 的 RPMI 1640 培 养
基 ，1 000 r/min 离心 5 min；离心结束后小心吸出上
TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司。Pam 3 CSK 4
购于 Bio-techne 公司。PMA 购于 Sigma 公司。引物 清，取 1 mL 培养液至离心管中，混匀吹打 3 次；将有
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合 成 由 Integrated DNA Technologies 公 司 合 成 。 细胞的 1 mL 培养液加至 75 cm 培养瓶中，再加入 12
Pierce TM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit 购 于 mL RPMI 1640 培养基（含 10% FBS、1% 10 U/mL
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Elabscience 公司。5×蛋白上样缓冲液购于 Siwega 青霉素和 10 mg/mL 链霉素混合液）至 75 cm 培养
生物科技有限公司。TRIS 和甘氨酸购于德国 Bio⁃ 瓶。每天观察细胞1次，2~3 d后，细胞培养基变黄及
FROxx公司。SDS和 Tween 20购于 Solarbio科技有 细胞铺满整个视野时（低倍镜）可进行细胞传代。
限公司。甲醇购于国药集团化学试剂有限公司。 细胞传代：将离心机转速调至 1 000 r/min，15

ECL 化学发光底物购于 Bio-Rad 公司。柯达医用 X mL 离心管离心 THP-1 细胞 5 min。小心弃去培养
射线胶片购于 Kodak公司。Ripa裂解液、PMSF和磷 基，再加入 3~5 mL 培养基吹打混匀，并于无菌条件
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酸化蛋白抑制剂购于赛维尔生物科技有限公司。 下将其转移至 75 cm 细胞培养瓶内。补加 RPMI
3）仪器设备。101-2AB 电热鼓风干燥箱，天津 1640 培养基（含 10% FBS、1% 10 U/mL 青霉素和
泰斯特仪器有限公司；BBS-SDC 洁净工作台，济南 10 mg/mL链霉素混合液）于培养箱内培养。
鑫贝西生物技术有限公司；ABI StepOnePlus 实时荧 细胞培养条件：37 ℃恒温，5% CO 2 。