Page 158 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第41卷 第5期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.41 No.5
2022年 9月 Journal of Huazhong Agricultural University Sep. 2022，152~160

进而减少巨噬细胞氧化型 LDL 的摄取和胆固醇沉
胡海娟，潘思轶.基于胆固醇外排、摄取与合成的柑橘果胶寡糖调控胆固醇代谢机制［J］.华中农业大学学报，2022，41（5）：152⁃160. 光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；Thermofish⁃
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.05.019 积，使巨噬细胞的泡沫化得到延缓 ［9］ 。尿石素 A 在 er Veriti 96 梯度 PCR 仪，美国应用生物系统公司；
显著上调 ABCA1和 ABCG1基因的表达来促进胆固 NanoDrop 微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific
基于胆固醇外排、摄取与合成的柑橘果胶胶寡糖 醇 排 出 的 同 时 能 够 抑 制 巨 噬 细 胆 固 醇 合 成 酶 公司；Anaerobox IV 厌氧培养箱，美国 GENE SCI⁃

HMGCR 的转录和翻译，从而减少胆固醇在巨噬细 ENCE 公司 ；DYY-6C 电泳槽 ，北京六一仪器厂 ；
调控胆固醇代谢机制 胞的沉积 ［10］ 。 TGL-16 高 速 离 心 机 ，苏 州 雨 泽 仪 器 有 限 公 司 ；

笔者所在团队前期研究发现，柑橘果胶寡糖 H1 SMR16.1 酶标仪，优尔生生命科学装备有限公司；
胡海娟，潘思轶 （POS H1 ）作为一种可以被肠道菌群水解利用的水溶 AX-Ⅱ暗匣，广东粤华医疗器械厂有限公司。

华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室/ 性膳食纤维，其对高脂膳食小鼠胆固醇水平具有明 1.2 POS H1 体外培养肠道菌群
果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室，武汉 430070 显的改善效果，且 POS H1 发挥调控胆固醇代谢作用 液体 LB 培养基配方：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提
与胆固醇排出和合成密切相关 ［11］ ，但具体机制还未 取物、5 g氯化钠，1 mol/L NaOH调pH至7.4，去离子
摘要 为揭示柑橘果胶寡糖 H1（POS H1 ）对胆固醇代谢的调控机制，采用巨噬细胞模型，基于胆固醇代谢外 见研究报道。因此，本研究采用巨噬细胞模型研究 水定容至 1 L，高压灭菌备用。POS H1 培养基：每 100
排、摄取与合成机制对 POS H1 调控胆固醇代谢进行了研究。结果显示：POS H1 和 POS H1 的肠道菌群发酵产物 POS H1 及其肠道菌群发酵产物对胆固醇排出、摄取以 mL液体LB培养基加入5 g POS H1 。
（P24）均通过显著上调肝 X 受体 α-ATP结合盒转运体 ABCA1/ABCG1通路中关键基因的蛋白表达量来促进巨
及合成功能的影响与机制，旨在为揭示 POS H1 的降 POS H1 体外培养：粪便接种液是将 10 人粪便经
噬细胞胆固醇外排。POS H1 对巨噬细胞胆固醇摄取相关基因的蛋白表达无显著影响，但 P24却可以通过显著抑
胆固醇机制提供理论依据。 0.01 mol/L 灭菌 PBS 缓冲液稀释为 0.1 g/mL 的粪便
制 A 类清道夫受体和分化抗原簇 36 的蛋白表达来抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取。POS H1 和 P24 均可通过显著
抑制胆固醇合成基因 3-羟基-3甲基-戊二酰辅酶 A 还原酶蛋白的表达来抑制巨噬细胞胆固醇的合成。研究结果 1 材料与方法 悬浮液，由瑞典卡罗林斯卡医学院 Clinical Microbiol⁃
ogy 系的 Christian G. Giske 教授实验室提供。将该
表明，POS H1 通过促进胆固醇排出、抑制胆固醇摄取与合成调控胆固醇代谢，这是 POS H1 调控胆固醇代谢的机制
1.1 试验材料 接种液按 1%（V/V）接种到 POS H1 培养基中，37.0 °C
之一，且该机制与肠道菌群发酵POS H1 有关。
1）试验原料。本研究所用原料为实验室自制的 厌氧培养 24 h，对照组为不加 POS H1 的 LB 液体培养
关键词 柑橘果胶；果胶寡糖；肠道菌群；胆固醇代谢；调控机制
柑橘果胶寡糖级分 H1（以下均简称为 POS H1 ），由过 基。24 h 后，4 °C、4 000 r/min 离心 10 min 取上清液
中图分类号 TS201.4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2022）05-0152-09
氧化氢高温水解柑橘皮果胶所得，方法见文献［12］。 收集，该上清液即为肠道菌群发酵产物。对照组的
高胆固醇血症作为心血管疾病的高风险因子， 巨噬细胞胆固醇代谢平衡稳态与高胆固醇血症 THP-1 细胞由卡罗林斯卡医学院 Division of Clinical 肠道菌群发酵产物记为 N24，POS H1 组的肠道菌群发
胆固醇外排、摄取与合成在其病理发展过程中起到 的病理发展过程密切相关 ，故巨噬细胞常被用于评 Chemistry提供。粪便接种液由瑞典卡罗林斯卡医学 酵产物记为 P24。上清液过 0.22 μm 滤膜后，−80 °C
［1］
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了重要作用。与正常人相比，家族性高胆固醇血症 价活性物质对胆固醇代谢调节作用及机制的研究 。 院 Clinical Microbiology 系 Christian G. Giske 教授实 储存待用。
患者体内负责胆固醇外排的 ATP 结合盒转运体 A1 ABCA1 和 ABCG1 是在巨噬细胞胆固醇排出过程中 验室提供。 1.3 THP-1细胞复苏与培养
基 因（ABCA1）和 ATP 结 合 盒 转 运 体 G1 基 因 起重要作用的一类膜蛋白，二者由核受体 LXRα 调 2）主要试剂。Gibco RPMI 1640 培养基、Gibco 取出−80 ℃冰箱冻存的细胞，将其于 37 ℃恒温
［5］
（ABCG1）表达被抑制，由此导致的胆固醇外排功能 控 。其中，ABCA1 负责将胆固醇从细胞外排到贫 胎 牛 血 清 、High capacity cDNA 反 转 录 试 剂 盒 、 水浴锅融化。随后，转移至 15 mL 无菌离心管离心；
［1］
受损是先天性的 。高胆固醇血症患者体内的胆固 脂的 apoA-I，ABCG1 则负责促进胆固醇外排到成熟 SYBR Green Master mix、LPS、蛋白 Marker 和蛋白 再加 入 8 mL 含 10% FBS、1% 10 U/mL 青 霉 素
［5］
醇代谢紊乱，有大量胆固醇沉积。原花青素通过降 HDL 粒子这一过程 。迷迭香酸通过增加 ABCA1 酶 抑 制 剂 均 购 于 Thermo Fisher Scientific 公 司 。 和 10 mg/mL 链 霉 素 混 合 液 的 RPMI 1640 培 养
基 ，1 000 r/min 离心 5 min；离心结束后小心吸出上
低 CD36 和 SR-A 的表达水平来抑制巨噬细胞的胆 和 ABCG1 的表达来促进巨噬细胞胆固醇排出，被认 TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司。Pam 3 CSK 4
购于 Bio-techne 公司。PMA 购于 Sigma 公司。引物 清，取 1 mL 培养液至离心管中，混匀吹打 3 次；将有
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固醇异常摄入 。为了降低高胆固醇血症患者体内 为是一种可以预防胆固醇代谢异常的潜在功能因
2
［6］
的胆固醇水平，抑制其内源合成也被认为是治疗高 子 。膳食纤维被肠道菌群利用后，会改变菌群及其 合 成 由 Integrated DNA Technologies 公 司 合 成 。 细胞的 1 mL 培养液加至 75 cm 培养瓶中，再加入 12
Pierce TM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit 购 于 mL RPMI 1640 培养基（含 10% FBS、1% 10 U/mL
胆固醇血症的有效手段之一。薇甘菊茎提取物因可 代谢物组成，而肠道菌群产生的代谢物可以通过上
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Elabscience 公司。5×蛋白上样缓冲液购于 Siwega 青霉素和 10 mg/mL 链霉素混合液）至 75 cm 培养
显著增加高胆固醇血症大鼠体内调控胆固醇合成的 调巨噬细胞中 ABCA1 基因的表达来促进胆固醇外
生物科技有限公司。TRIS 和甘氨酸购于德国 Bio⁃ 瓶。每天观察细胞1次，2~3 d后，细胞培养基变黄及
［7］
3-羟基-3 甲基-戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGCR）活 排 。巨噬细胞通过 CD36和 SR-A摄取修饰膜蛋白
FROxx公司。SDS和 Tween 20购于 Solarbio科技有 细胞铺满整个视野时（低倍镜）可进行细胞传代。
［3］
性，被认为是一种良好的抗高胆固醇活性物质 。因 入胞，会促进胆固醇沉积，形成泡沫细胞，且该摄取
限公司。甲醇购于国药集团化学试剂有限公司。 细胞传代：将离心机转速调至 1 000 r/min，15
［8］
此，促进胆固醇外排、抑制胆固醇摄取与合成是预防 不受细胞内胆固醇浓度的负反馈调节 。蓝莓可以
ECL 化学发光底物购于 Bio-Rad 公司。柯达医用 X mL 离心管离心 THP-1 细胞 5 min。小心弃去培养
与治疗高胆固醇血症的重要措施。 显著抑制小鼠巨噬细胞 SR-A 和 CD36 基因的表达，
射线胶片购于 Kodak公司。Ripa裂解液、PMSF和磷 基，再加入 3~5 mL 培养基吹打混匀，并于无菌条件
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收稿日期：2022⁃07⁃08 酸化蛋白抑制剂购于赛维尔生物科技有限公司。 下将其转移至 75 cm 细胞培养瓶内。补加 RPMI
基金项目：财政部与农业农村部：国家柑橘产业技术体系（CARS-26-07B）；中央高校基本科研业务费专项（2662020SPPY011）；云南省重 3）仪器设备。101-2AB 电热鼓风干燥箱，天津 1640 培养基（含 10% FBS、1% 10 U/mL 青霉素和
大科技专项（202102AE090054）；湖北省重大科技专项（2022BBA0030）
泰斯特仪器有限公司；BBS-SDC 洁净工作台，济南 10 mg/mL链霉素混合液）于培养箱内培养。
胡海娟，E-mail：huhaijuan@163.com
通信作者：潘思轶，E-mail：siyipan401@163.com 鑫贝西生物技术有限公司；ABI StepOnePlus 实时荧 细胞培养条件：37 ℃恒温，5% CO 2 。