Page 160 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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               1.4  THP-1细胞分化                                   移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4 ℃、12 000
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                   待 THP-1 细胞数目维持在 1×10 个/mL，生长                 r/min 离心 5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。每个
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               状况良好，以 5.6×10 个/mL 细胞均匀接种于 12 孔                  样品总蛋白溶液加入 5×loading buffer，涡旋混匀，
               板中，每组 6 个复孔。在接种细胞的同时，给予 100                      98 ℃加热10 min，−80 ℃保存。
               ng/mL PMA 诱导 48 h，将 THP-1单核细胞诱导为巨                    2）SDS-PAGE电泳。根据蛋白的相对分子质量
               噬细胞，48 h 后，小心弃去旧培养基，用灭菌 PBS 缓                    大小，配制 10% 的分离胶和 5% 的浓缩胶，为防止胶
               冲液充分洗涤2次，去除不贴壁细胞及死亡细胞。                           凝固应在加入 TEMED 后立即灌胶；将干净的玻璃
               1.5  POS H1 和P24处理THP-1巨噬细胞                      板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加水液
                   向分化好的细胞中加入 RPMI 1640 培养基（含                   封除去气泡。待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中水
               10% FBS、1% 10 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素             分，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻
               混合液），分别给予POS H1 和P24，共15组。                       轻拔出梳子；处理好的各组蛋白样品进行电泳。浓
                   1）POS H1 效果研究。分别为阴性对照组（NC）、 缩胶电压为 80 V，分离胶电压为 130 V，待条带到达
               POS H1 （5 mg/mL）、Pam 3 CSK 4 （Pam，20 ng/mL）、 玻璃板底部时结束电泳。
               LPS （10 ng/mL） 、POS H1 +Pam 3 CSK 4 （PP） 和           3）转膜。PVDF 膜于甲醇中活化 1 min，将夹子
               POS H1 +LPS（PL），共 6 组。其中，Pam 3 CSK 4 和 LPS       的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上
              （分别为 TLR2 和 TLR4 激动剂）组为阳性对照组。 依次放入 1 层海绵垫、3 层滤纸、分离胶、PVDF 膜、3
               POS H1 预处理THP-1巨噬细胞1 h，其余组各加等体积                  层滤纸，最后盖上 1 层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，
               灭 菌 PBS 缓 冲 液 ；1 h 后 各 组 相 应 加 入 LPS 或           加入预冷的转膜液，设定电流为 250 mA，于冰浴中
               Pam 3 CSK 4 处理 6 h（共计 7 h）后，收集细胞用于 PCR           转膜1 h。
               检测。                                                  4）封闭。将上一步转好的 PVDF 膜放入适量
                   2）肠道菌群发酵产物效果研究。分别为阴性对                        5%脱脂奶粉中，于脱色摇床上振荡封闭1 h。
               照 组（NC）、P24（1%，V/V）、N24（1%，V/V）、                     5）孵育一抗。一抗按照试剂与耗材表中的比例
               Pam 3 CSK 4 （Pam，20 ng/mL）、LPS（10 ng/mL）、 用一抗稀释液稀释，将封闭后的 PVDF 膜装入杂交
               P24+Pam 3 CSK 4 （P24P）、P24+LPS（P24L）、N24+        袋中4 °C孵育过夜。用TBST洗5次，每次5 min。
               Pam 3 CSK 4 （N24P）和N24+LPS（N24L），共9组。其               6）孵育二抗。二抗按照试剂与耗材表中的比例
               中，Pam 3 CSK 4 和LPS组（分别为TLR2和TLR4激动               用 5% 脱 脂 奶 粉 稀 释 。 将 膜 二 抗 中 孵 育 1 h。 用
               剂）为阳性对照组。P24 或者 N24 预处理 THP-1 巨                  TBST洗5次，每次5 min。
               噬细胞 1 h，其余组各加等体积灭菌 PBS 缓冲液；1 h                       7）显影。滴加新鲜配制的 ECL 混合溶液到膜的
               后再加入 LPS 或 Pam 3 CSK 4 处理 6 h（共计 7 h）后，收         蛋白面侧，发光检测；根据不同的光强度调整曝光条
               集细胞用于后续试验检测。                                     件，显影、定影。将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC
               1.6  应用Western blot法检测蛋白的表达量                     软件处理系统分析目标带的光密度值。
                   1）细胞中总蛋白提取和变性。RIPA 工作液使                      1.7  数据分析
               用时先加入各种抑制剂，1 mL RIPA 工作液=790                         所有试验至少重复 3次，结果按平均值±标准误
               μL RIPA+100 μL 蛋白酶抑制剂母液（10×）+100                 差（SEM）表示。采用 Excel 软件对试验数据进行整
               μL 磷酸化蛋白酶抑制剂母液（10×）+10 μL 100                    理，使用 GraphPad Prism 7.0 进行 Mann-Whitney 检
               mmol/L PMSF 母液。RIPA 工作液配好后，放在冰                   验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
               上预冷。用 TBS 缓冲液润洗贴壁细胞 2~3 次，最后                     2   结果与分析
               1 次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白
               提取试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培                          2.1  POS H1 对巨噬细胞胆固醇外排相关基因表达
               养板/瓶内裂解 3~5 min。期间反复震动培养板/瓶， 的影响
               使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂                               ABCA1 和 ABCG1 是介导机体胆固醇外排的基
               刮下，收集到 1.5 mL 离心管中。冰浴 30 min，期间用                 因，且二者的表达受 LXRα 受体的调控。POS H1 对巨
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