Page 239 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期
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第 5 期           张梦婷 等：表没食子儿茶素没食子酸酯和茶黄素对秀丽隐杆线虫耐温性的影响                                       233

               延长寿命。但是将二者应用于秀丽隐杆线虫进行                            等 ［19］ 。冷应激试验每天计数线虫的死亡情况，直至
               冷、热应激考察和机制研究未见报道。基于此，本研                          所有线虫死亡，试验温度设置参考Liu等               ［20］ 。
               究以秀丽隐杆线虫为生物模型，体外模拟冷、热环境                          1.4  脂肪含量测定
               温度，探究绿茶和红茶中的代表性组分——EGCG                              将同步化 64 h 后的秀丽隐杆线虫分别转移到含
               和 TF1 对秀丽隐杆线虫冷、热应激下存活率的影响， 有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平板上，于不同温度（4、
               进一步测定 EGCG 和 TF1对不同温度条件下秀丽隐                      20、30 ℃）条件下分别孵育 1、5和 7 d。用提前冰浴的
               杆线虫体内脂肪含量和线粒体膜电位水平的影响， S-basal 缓冲液收集线虫，洗涤 3 次以除去残留的菌
               对 EGCG 和 TF1在不同温度下发挥保护作用的机制                      液，随后将线虫转移至 2 mL 离心管并置于液氮中速
               进行了初探，以期为茶多酚生热研究和秀丽隐杆线                           冻成颗粒。将线虫颗粒在液氮预冷的研钵中与 200
               虫耐温性研究提供新思路。                                     μL 5% Triton TM  X-100 一起研磨，收集虫体粉末后置
                                                                于冰上保存。以 30% 振幅超声 10 min，随后在 4 ℃条
               1    材料与方法
                                                                件以 12 300 r/min 离心 15 min。收集离心后的上清
               1.1  材料与试剂                                       液，使用甘油三酯（TG）测试盒测定不同温度条件下
                   N2野生型秀丽隐杆线虫、大肠杆菌 OP50（E. co⁃                 秀丽隐杆线虫体内的脂肪含量。同时，使用 BCA 蛋
               li OP50），Caenorhabditis Genetics Center（CGC）；表   白测试盒测定秀丽隐杆线虫体内的蛋白质含量。试
               没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，≥95%）、牛血清                       验结果以蛋白质含量做归一化处理。
               白蛋白（BSA）、Triton     TM X-100、胆固醇、蛋白胨、甘           1.5  线粒体膜电位测定
               油，美国 Sigma-Aldrich 公司；茶黄素（TF1，98%），成                 线粒体膜电位（mitochondrial membrane poten⁃
               都普瑞法科技开发有限公司；四甲基罗丹明乙酯                            tial，MMP）水平使用线粒体特异性染料四甲基罗丹明
              （TMRE）、羰基氰基-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）， 乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）检测。
               上海源叶生物科技有限公司；LB 培养基，美国英杰                         试 验 以 1 μmol/L FCCP 为 阳 性 对 照 ，100 μmol/L
               生命技术有限公司；琼脂（BR 组培级），北京兰杰柯                        TMRE 为荧光染料。试验时将同步化 64 h 后的秀丽
               科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO），AppliChem 公                   隐杆线虫分别转移到含有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平
               司；BCA 蛋白测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific           板上，于不同温度（4、20、30 ℃）条件下孵育 1 h、2 h、
               公司；甘油三酯（TG）测定测试盒，南京建成生物工                         12 h、24 h、5 d 和 7 d。 提 前 制 备 热 灭 活 的 E. coli
               程研究所；盐酸、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯                        OP50 菌液，与 100 μL 浓度为 100 μmol/L 的 TMRE
               化钙、硫酸镁、氢氧化钾，国药集团化学试剂有限公                          检测液混合后涂布于 NGM 平板上，避光吹干。用
               司；S-basal 缓冲液（1.47 g K 2 HPO 4 、5.93 g KH 2 PO 4 、 S-basal缓冲液分别收集孵育1、2、12、24 h及5 d和7 d
               5.85 g NaCl 溶于 1 L 超纯水，121 ℃灭菌 20 min）。          的线虫，转移至含有 TMRE 染料的平板上，于 20 ℃
               1.2  秀丽隐杆线虫的培养                                   下孵育 2 h。孵育结束后，用 S-basal 缓冲液收集线
                   提前制备涂布有 E. coli OP50 菌液的线虫生长                 虫，转移至含有热灭活 E. coli OP50 菌液的 NGM
               培养基（nematode growth medium，NGM）平板，每              平板上使其自由爬行 1 h。最后收集线虫，以 100
               5 d 将成年线虫转移到平板上，每次挑取 4~5 条，置                     μL/孔将线虫悬浮液加至黑色 96 孔酶标板中。荧光
               于20 ℃生化培养箱中进行恒温培养。                               强度测定条件为激发波长 540 nm、发射波长 595 nm。
               1.3  热、冷应激试验                                     测定完毕后，使用 0.01% Triton       TM  X-100 回收 96 孔
                   将同步化 64 h 后的秀丽隐杆线虫分别转移到                      板中的线虫，同本文“1.4”步骤中超声破碎、离心，使
               含有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平板上，于 20 ℃下孵育                用BCA法测定蛋白质含量。试验结果以蛋白质含量
               5 d，每天使用 S-basal 缓冲液收集秀丽隐杆线虫后转                   做归一化处理。
               移至新的 NGM 平板中以避免产卵带来的干扰。热、 1.6                         蛋白质含量测定
               冷应激试验以 DMSO 为空白对照，每组 3 个平行，每                         使用 BCA蛋白测定试剂盒测定秀丽隐杆线虫体
               个平行挑取约 20 条线虫分别置于 35、4 ℃温度条件                     内的蛋白质含量。取超声破碎、离心后的线虫上清
               下培养。热应激试验每小时计数 1 次线虫的死亡情                         液，按照BCA蛋白测定试剂盒的操作说明加样，37 ℃
               况，直至所有线虫死亡，试验温度设置参考 Wilson                       条件下孵育30 min后于波长562 nm处测定吸光值。
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