Page 238 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第41卷 第5期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.41 No.5
2022年 9月 Journal of Huazhong Agricultural University Sep. 2022，232~239

延长寿命。但是将二者应用于秀丽隐杆线虫进行 等 ［19］ 。冷应激试验每天计数线虫的死亡情况，直至
张梦婷，李斌，田静.表没食子儿茶素没食子酸酯和茶黄素对秀丽隐杆线虫耐温性的影响［J］.华中农业大学学报，2022，41（5）：232⁃239.
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.05.028 冷、热应激考察和机制研究未见报道。基于此，本研 所有线虫死亡，试验温度设置参考Liu等 ［20］ 。
究以秀丽隐杆线虫为生物模型，体外模拟冷、热环境 1.4 脂肪含量测定
表没食子儿茶素没食子酸酯和茶黄素对 温度，探究绿茶和红茶中的代表性组分——EGCG 将同步化 64 h 后的秀丽隐杆线虫分别转移到含

和 TF1 对秀丽隐杆线虫冷、热应激下存活率的影响， 有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平板上，于不同温度（4、
秀丽隐杆线虫耐温性的影响 进一步测定 EGCG 和 TF1对不同温度条件下秀丽隐 20、30 ℃）条件下分别孵育 1、5和 7 d。用提前冰浴的
杆线虫体内脂肪含量和线粒体膜电位水平的影响， S-basal 缓冲液收集线虫，洗涤 3 次以除去残留的菌
张梦婷，李斌，田静 对 EGCG 和 TF1在不同温度下发挥保护作用的机制 液，随后将线虫转移至 2 mL 离心管并置于液氮中速

华中农业大学食品科学技术学院/环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070 进行了初探，以期为茶多酚生热研究和秀丽隐杆线 冻成颗粒。将线虫颗粒在液氮预冷的研钵中与 200
虫耐温性研究提供新思路。 μL 5% Triton TM X-100 一起研磨，收集虫体粉末后置
摘要 为探究绿茶和红茶中的代表性组分对秀丽隐杆线虫在不同温度条件下的作用效果及机制，试验设置 于冰上保存。以 30% 振幅超声 10 min，随后在 4 ℃条
0.25、2.5、25 μmol/L 表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和茶黄素（theaflavin，TF1），测 1 材料与方法 件以 12 300 r/min 离心 15 min。收集离心后的上清
定线虫在 4 ℃和 35 ℃条件下的存活率，进而测定在 4 ℃、20 ℃和 30 ℃条件下经 25 μmol/L EGCG 和 TF1 孵育后 1.1 材料与试剂 液，使用甘油三酯（TG）测试盒测定不同温度条件下
线虫体内脂肪含量和线粒体膜电位的变化。结果显示，25 μmol/L EGCG 将热应激线虫的最大寿命和中位寿命 N2野生型秀丽隐杆线虫、大肠杆菌 OP50（E. co⁃ 秀丽隐杆线虫体内的脂肪含量。同时，使用 BCA 蛋
分别提高了 8.15%、22.44%，将冷应激线虫的最大寿命和中位寿命分别降低了 20.25%、17.94%。25 μmol/L
li OP50），Caenorhabditis Genetics Center（CGC）；表 白测试盒测定秀丽隐杆线虫体内的蛋白质含量。试
TF1对热应激线虫的存活率无显著影响，将冷应激线虫的最大寿命和中位寿命分别提高了 9.43%、19.01%。在
没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，≥95%）、牛血清 验结果以蛋白质含量做归一化处理。
4 ℃条件下，EGCG 和 TF1 孵育均提高了线虫体内的脂肪含量，TF1 孵育降低了线虫的线粒体膜电位水平。在
白蛋白（BSA）、Triton TM X-100、胆固醇、蛋白胨、甘 1.5 线粒体膜电位测定
20 ℃条件下，EGCG 和 TF1 具有明显的降脂作用，长时间孵育可显著提高衰老线虫线粒体活性。在 30 ℃条件
油，美国 Sigma-Aldrich 公司；茶黄素（TF1，98%），成
下，EGCG 和 TF1提高了线虫体内的脂肪含量。以上结果表明，在低温条件下 TF1通过促进线粒体产热而非脂 线粒体膜电位（mitochondrial membrane poten⁃
都普瑞法科技开发有限公司；四甲基罗丹明乙酯 tial，MMP）水平使用线粒体特异性染料四甲基罗丹明
肪动员提高了线虫的存活率，而EGCG孵育可诱导线虫死亡。
关键词 秀丽隐杆线虫；表没食子儿茶素没食子酸酯；茶黄素；耐温性；线粒体膜电位 （TMRE）、羰基氰基-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）， 乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）检测。
中图分类号 TS272 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2022）05-0232-08 上海源叶生物科技有限公司；LB 培养基，美国英杰 试 验 以 1 μmol/L FCCP 为 阳 性 对 照 ，100 μmol/L
生命技术有限公司；琼脂（BR 组培级），北京兰杰柯 TMRE 为荧光染料。试验时将同步化 64 h 后的秀丽
［9］
［8］
流行病学研究表明，饮茶具有多种健康益处，日 TFs 具有抗氧化 、预防神经退行性疾病 、调节血 科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO），AppliChem 公 隐杆线虫分别转移到含有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平
常生活中长期习惯性饮茶与高血压发病率和认知障 糖 ［10］ 等多种生物学活性。 司；BCA 蛋白测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific 板上，于不同温度（4、20、30 ℃）条件下孵育 1 h、2 h、
碍风险呈负相关 ［1-2］ 。绿茶中含量最多的茶多酚是儿 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种 公司；甘油三酯（TG）测定测试盒，南京建成生物工 12 h、24 h、5 d 和 7 d。 提 前 制 备 热 灭 活 的 E. coli
茶素类物质，而儿茶素中又以表没食子儿茶素没食 发育迅速、生命周期短的非寄生线虫 ［11］ 。20 世纪 70 程研究所；盐酸、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯 OP50 菌液，与 100 μL 浓度为 100 μmol/L 的 TMRE
子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）含量最高，约 年代，Brenner ［12］ 首次将秀丽隐杆线虫作为一种神经 化钙、硫酸镁、氢氧化钾，国药集团化学试剂有限公 检测液混合后涂布于 NGM 平板上，避光吹干。用
［3］
占总量的 50%~75% 。作为儿茶素中最有效的活 科学模型引入研究，使其成为第一个拥有完整基因 司；S-basal 缓冲液（1.47 g K 2 HPO 4 、5.93 g KH 2 PO 4 、 S-basal缓冲液分别收集孵育1、2、12、24 h及5 d和7 d
［4］
性成分，EGCG具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用 。茶 组测序的多细胞生物。秀丽隐杆线虫有 60%~80% 5.85 g NaCl 溶于 1 L 超纯水，121 ℃灭菌 20 min）。 的线虫，转移至含有 TMRE 染料的平板上，于 20 ℃
黄素类物质（theaflavins，TFs）主要是由儿茶素及其 的基因与人类基因同源，42% 的人类疾病基因在秀 1.2 秀丽隐杆线虫的培养 下孵育 2 h。孵育结束后，用 S-basal 缓冲液收集线
衍生物在多酚氧化酶等酶的催化作用下氧化缩合而 丽隐杆线虫基因组中存在清晰的同源物 ［13］ ，因此使 提前制备涂布有 E. coli OP50 菌液的线虫生长 虫，转移至含有热灭活 E. coli OP50 菌液的 NGM
成的具有苯骈卓酚酮结构的一类化合物的总称 ，在 得秀丽隐杆线虫作为模式生物在研究药物筛选和人 培养基（nematode growth medium，NGM）平板，每 平板上使其自由爬行 1 h。最后收集线虫，以 100
［5］
红茶中的含量约为 0.5%~3%，是决定红茶品质的关 类疾病机制等方面成为可能。目前将 EGCG 和 TFs 5 d 将成年线虫转移到平板上，每次挑取 4~5 条，置 μL/孔将线虫悬浮液加至黑色 96 孔酶标板中。荧光
［6］
键成分，影响红茶口感的醇厚度与鲜爽度 。目前发 应用于秀丽隐杆线虫的研究主要集中在抗衰老 ［14］ 、 于20 ℃生化培养箱中进行恒温培养。 强度测定条件为激发波长 540 nm、发射波长 595 nm。
现并鉴定的 TFs 有 28 种，其中含量最多的是茶黄素 抗氧化应激 ［15］ 、抗渗透应激和紫外应激 ［16］ 等方面。 1.3 热、冷应激试验 测定完毕后，使用 0.01% Triton TM X-100 回收 96 孔
（theaflavin，TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin- 已有研究表明，EGCG 和富含茶黄素的组分可增加 将同步化 64 h 后的秀丽隐杆线虫分别转移到 板中的线虫，同本文“1.4”步骤中超声破碎、离心，使
3-gallate，TF2a）、茶黄素-3′-没食子酸酯（theaflavin- 能量消耗、促进生热 ［17-18］ 。在低温条件下秀丽隐杆 含有 EGCG 和 TF1 的 NGM 平板上，于 20 ℃下孵育 用BCA法测定蛋白质含量。试验结果以蛋白质含量
3′-gallate，TF2b）和茶黄素双没食子酸酯（theaflavin- 线虫通过 TRP 通道延长寿命，高温条件下通过上调 5 d，每天使用 S-basal 缓冲液收集秀丽隐杆线虫后转 做归一化处理。

3，3′-digallate，TF3）4 种单体 ［7］ 。众多研究表明， 应激相关基因的表达来提供较强的应激保护，进而 移至新的 NGM 平板中以避免产卵带来的干扰。热、 1.6 蛋白质含量测定
冷应激试验以 DMSO 为空白对照，每组 3 个平行，每 使用 BCA蛋白测定试剂盒测定秀丽隐杆线虫体
收稿日期：2022-05-19 个平行挑取约 20 条线虫分别置于 35、4 ℃温度条件 内的蛋白质含量。取超声破碎、离心后的线虫上清
基金项目：中央高校基本科研业务费专项（2662020SPPY010）
下培养。热应激试验每小时计数 1 次线虫的死亡情 液，按照BCA蛋白测定试剂盒的操作说明加样，37 ℃
张梦婷，E-mail：1510594838@qq.com
通信作者：田静，E-mail：jing.tian@mail.hzau.edu.cn 况，直至所有线虫死亡，试验温度设置参考 Wilson 条件下孵育30 min后于波长562 nm处测定吸光值。