Page 231 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第5期

第 5 期 胥婷婷 等：生姜提取物缓解秀丽隐杆线虫热胁迫的研究 225

li OP50的新的NGM板中，于20 ℃恒温培养箱培养。 虫在受到紫外线或强光刺激下头部或尾部轻微摆
2）试验所用线虫株系同步化。待线虫处于产卵 动；B 类介于 A、C 之间的运动。
期，用 M9 缓冲液（pH=7.4）冲洗到 2 mL 离心管中并 1.5 热休克蛋白HSP-16.2表达量测定试验
离心（20 ℃，12 000 r/min，1 min）。离心后弃上清，再 将 同 步 化 至 L1 时 期 转 基 因 株 系 CL2070
用 M9 缓冲液清洗并离心去上清，重复清洗 3 次。最 （HSP-16.2：：GFP）线虫转移至含有 6 mg/mL 灭活
后 1次弃上清后，加入 1 mL 裂解液，手动震荡至虫体 的 E. coli OP50 的 S-Complete 液体培养基中，并分
完全裂解后离心（20 ℃，12 000 r/min，1 min），离心后 别加入终质量浓度为 0（0.1% DMSO 作对照）、30、
弃上清，用 M9再清洗 3次。最后 1次离心结束后，弃 60 和 120 μg/mL GE 进行处理，于 20 ℃孵育 3 d。收
上清，将离心管底部虫卵转移至涂有 E. coli OP50 的 集线虫，用 M9 缓冲液洗涤 3 次后置于载玻片上，用
NGM 板中，并放置 20 ℃培养箱。根据株系及试验要 50 mmol/L 叠氮化钠麻醉。利用倒置荧光显微镜对
求选择不同生长时期的幼虫进行试验。 每个处理组的线虫（随机取 30 只）进行拍摄。通过
1.4 秀丽隐杆线虫热应激寿命及运动能力试验 ImageJ（ImageJ Software，Bethesda，MD，USA）计算
将 同 步 化 至 L4 时 期 的 野 生 型 幼 虫 分 别 用 0 CL2070线虫中 HSP-16.2的蛋白平均荧光强度，以确
（0.1% DMSO 作对照）、30、60、120、240、360 和 480 定不同药物处理组其相对表达量。
μg/mL GE 在含有 6 mg/mL 灭活的 E. coli OP50 的 1.6 HSR相关基因mRNA表达量测定试验
S-Complete液体培养基中处理6 d。在成虫第5天，将 将同步化至 L4 时期的野生型线虫转移至含有
药物处理后的线虫转移到新的含有 M9 缓冲液的 96 6 mg/mL 灭活的 E. coli OP50 的 S-Complete 液体培
孔板中，并对其进行热应激处理，温度为 37 ℃。每隔 养基中，用 60 μg/mL 的 GE 处理，于 20 ℃孵育 3 d。
2 h对其存活率进行记录，直至所有线虫死亡（当线虫 收集线虫并用 M9进行洗涤，随后进行热应激。瞬时
对紫外线或强光照射没有反应时，则判定为死亡）。 热应激 试 验 ：将 线 虫 在 37 ℃下 孵 育 15 min，再 于
对暴露于热应激下 1、2、3 h 的野生型线虫进行 20 ℃恢复 30 min；持续热应激试验：将线虫在 37 ℃
运动状态分析。线虫的培养和给药方式与热应激寿 下孵育 60 min，再于 20 ℃恢复 30 min，随后进行研
命试验中一致。在成虫第 5天，将处理后的线虫转移 磨 、RNA 提 取 ［4］ 。 以 基 因 actin-1 作 为 内 源 性 对
到新的含有M9缓冲液的96孔板中，对其进行热应激 照，采用 2 -ΔΔCT 法计算 mRNA 表达水平的相对变化
处理并在热应激 1、2、3 h 后分别对其运动状态进行 量 。 相 关 基 因 的 引 物 序 列 参 考 qPrimerDB-qPCR
观察，并根据不同的运动状态分为 ABC 三类。具体 Primer Database（https：//biodb. swu. edu. cn/qprim⁃
是：A 类指线虫自发的进行余弦曲线运动；C 类指线 erdb/）。

表1 秀丽隐杆线虫HSR相关基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of genes related to heat shock response in Caenorhabditis elegans

基因 Gene 正向引物（5'-3') Forward primer 反向引物（5'-3') Reverse primer
actin-1 CCAGGAATTGCTGATCGTATGCAGAA TGGAGAGGGAAGCGAGGATAGA

hsf-1 CCGCAACAAGACTATTCGGG TGGTGGATGAGGTGGAAGTC
hsp-16.2 CTGCAGAATCTCTCCATCTGAGTC AGATTCGAAGCAACTGCACC
hsp-70 AAAATCCCATCCCCAAACCTAT GGAGTTGGAACTGATACGTGAT
hsp-90 TGTCCGAACGGAAA GTCGACCTTCCATGCG
1.7 数据统计与分析 2 结果与分析
线 虫 生 存 曲 线 用 GraphPad Prism 8 作 图 并 用
2.1 GE 中姜辣素、总酚、总黄酮、总糖和总蛋白
SPSS 进行 log-rank 分析，采用 ANOVA 进行显著性
含量
分析，P<0.05 表示具有显著性差异。所有试验进行
测定GE中姜辣素、总酚、总黄酮、总糖和总蛋白含
3 次重复，线虫寿命试验的数据以“平均值±标准误 量，对应标准品所得的标准曲线分别为Y=0.031X+
2
2
差”表示，其余试验数据以“平均值±标准偏差” 0.0652（R =0.998 8）、Y=0.0023X-0.0262 （R =
2
表示。 0.996 5）、Y=0.0055X+0.0071（R =0.998 1）、Y=